De forma resumida,
o DNA fúngico foi extraído como mostra o esquema da figura 1-1 e centrifugado (ThermoScientific Fresco 21) para separar
os detritos celulares, em seguida, o sobrenadante foi reservado até a
utilização. A amplificação foi realizada com kit comercial NZYTaq II 2×
Green Master Mix (NZYtech-Portugal), uma solução pronta para uso, pois já
contém NZYTaq II DNA polimerase, dNTPs, tampão de reação e aditivos em
concentrações otimizadas, facilitando a amplificação eficiente de templates de
DNA até 6 kb (concentração final de MgCl2 - 2,5 mM). Como iniciadores (primers)
ITS foram utilizadas as regiões ITS1 (forward) e a região ITS4 (reverse). As condições do PCR (Bio-Rad T100 Termal
Cycler) são mostradas no esquema. A temperatura de anelamento de 52 ºC foi
escolhida por orientação do fabricante dos primers. Para a técnica de PCR em
tempo real (Bio-Rad C1000 Touch Termal Cycler), foram utilizadas sequências do
gene actina, sendo o primer forward TCTGTTATGTTGCTCTTGAT e o reverse
GTTCGTATGACTTCTCCAA, numa concentração final de 0,25µM e num volume de 0,8 µL cada. Os reagentes
utilizados para o qPCR foram água destilada estéril (6,4 µL), Speed NZYTaq 2x
Green Master Mix como fluorescente (10 µL) e 2 µL da amostra de DNA molde
extraído das videiras analisadas. Figura
1-2. As condições no termociclador foram: desnaturação inicial a 95 ºC /
3 min com 1 ciclo, desnaturação e emparelhamento/extenção a 95 ºC / 5 seg e 60
ºC / 15 seg, respetivamente, ambas com 40 ciclos. A eletroforese para avaliar a
qualidade e pureza do DNA foi feita como descrito no esquema da figura 1-3.
Protocolo realizado na Universidade de Aveiro na disciplina Metodologia e Prática em Microbiologia/42206, sob a orientação do Profº Drº Micael Gonçalves
1. A extração de DNA
A extração de DNA deve ser bem executada, seguindo o protocolo com rigor. De modo geral, o que se quer é romper a célular para expor o material genético e isto pode ser feito de várias maneiras, dependendo da amostra e do material disponível. Muitos laboratórios dispoem de Kits comerciais, como por exemplo: NZY Plant/Fungi gDNA Isolation (NZYTech, Portugal).
Ordem do processo:
Coleta da amostra – Preparar as células para a extração.
Lise celular – Romper as células para liberar o DNA.
Remoção de contaminantes – Separar proteínas e resíduos.
Ligação do DNA à membrana de sílica – Capturar o DNA.
Lavagem – Remover impurezas com etanol.
Eluição – Recuperar o DNA em solução.
Armazenamento e análise de qualidade – Garantir a integridade do DNA extraído.
👉Protocolo completo com kits comerciais: Part 1, 2 e 3
A análise da qualidade do DNA é importante para evitar que, após adicionar os primers para utilizar a técnica do PCR convencional, durante leitura dos resultados no gel de agarose ou SDS-PAGE, você consiga enxergar as bandas da sua amostra. E como você pode verificar a qualidade do seu DNA? É muito simples. Basta transferir 5 μL da amostra desejada (DNA ou RNA) e adicionar 995 μL de Tris 10 mM, pH 7,5. Depois você deve diluir o conteúdo (1:10) e transferir para uma cuvete de quartzo para ser lido por um especfotômetro com uma absorvância de 260 e 280, depois faça a divisão e veja se os valores encontrados estão entre 1,4 e 2. Isto significa que o seu DNA está com uma excelente qualidade . Exemplo de protocolo aqui
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