Protocolos Laboratoriais para Totós

Created in BioRender.  Dallavecchia, D.L (2025)  https://BioRender.com/z53a801   Antes de iniciar este protocolo, você terá de ter realizado a extração de DNA  ou RNA . Num microtubo contendo 5 μL da amostra desejada (DNA ou RNA) foram adicionados 995 μL de Tris 10 mM, pH 7,5. O conteúdo foi diluído (1:10) e transferido para uma cuvete de quartzo onde a absorvância a 280 e 260 foi medida. Este protocolo foi desenvolvido e realizado no Laboratórios de Biologia Molecular e Celular/47409 da Universidade de Aveiro Quantificação de DNA por espectrofotometria A medição da quantidade de DNA por espectrofotometria baseia-se na capacidade do DNA em solução de absorver luz a um comprimento de onda de 260 nm. Quanto maior for a luz absorvida nesse comprimento de onda, maior será a concentração de DNA na solução. Sabendo que uma absorbância (A) de 1,0 equivale a 50 µg de DNA de cadeia dupla por mililitro (mL), é possível determinar a concentração de DNA presente nas amostras ana...

Created in BioRender.  Dallavecchia, D.L (2025)  https://BioRender.com/z53a801    A quantificação foi realizada com NZYSupremeqPCR Green Master Mix (NZYTech, Portugal), contendo enzima hot-start e tampões otimizados. Uma amostra de DNA ambiental de planta foi fornecida, já diluída (1:10). O mix foi preparado com 10 µL de master mix, 6,4 µL de água estéril, 0,8 µL de primer forward, 0,8 µL de primer reverse e 1 µL de DNA. As condições de qPCR no termociclador foram: 95 °C por 3 min (inicial), seguido de 40 ciclos de 95 °C por 5 seg e 60 °C por 15seg. Os resultados foram analisados em tempo real no software do termociclador. Este protocolo foi desenvolvido e realizado no Laboratórios de Biologia Molecular e Celular/47409 da Universidade de Aveiro    Maiores informações PCR

                    Created in BioRender.  Dallavecchia, D.L (2025)  https://BioRender.com/z53a801     Amplificação de ácidos nucleicos por PCR e quantificação por qPCR A amplificação foi realizada com NZYTaq II 2× Green Master Mix (NZYTech, Portugal), que contém Taq polimerase, dNTPs e tampão de reação. O DNA foi diluído (1:10), e o mix de reação preparado com 6,25 µL de master mix, 14,75 µL de água estéril, 1 µL de primer forward (5’ TCTGTTATGTTGCTCTTGAT 3'), 1 µL de primer reverse (5’ GTTCGTATGACTTCTCCAA 3’) e 2 µL de DNA. As condições de PCR no termociclador ( Thermocycler ®) foram: 95 °C por 3 min (inicial), desnaturação da actin a 95 ºC por 3 min, Anelamento a 53 °C por 30 seg, a extensão a  72 °C por 30 seg, com 35 ciclos e com extensão final a 72 °C por 5 min. O produto foi analisado em gel de agarose. Antes de iniciar este protocolo, você terá de ter realizado a extração de  DNA . Este protocolo f...

Created in BioRender.  Dallavecchia, D.L (2025)  https://BioRender.com/z53a801   O RNA total foi extraído usando o kit NZY Total RNA Isolation ( NZYTech , Portugal). Cerca de 100 mg de micélio foram triturados em nitrogénio líquido, lisados com tampão NR e β-mercaptoetanol, e clarificados numa coluna NZYSpin Homogenization. O eluído foi misturado com etanol a 70% e transferido para uma coluna NZYSpin Binding. Após lavagens com tampões NI, NWR1 e NWR2, o RNA foi eluído com água livre de RNase e armazenado a -20 °C. Este protocolo foi desenvolvido e realizado no Laboratórios de Biologia Molecular e Celular/47409 da Universidade de Aveiro Por que extrair RNA? O objetivo da extração de RNA é obter RNA purificado de alta qualidade de amostras biológicas para análise transcriptómica para aplicações como sequenciamento, análise de transcriptoma e testes de patógenos infeciosos. O RNA é uma molécula instável, principalmente porque ele pode ser degradado por RNAses, as quais estã...