Protocolo PCR
A amplificação foi realizada com NZYTaq
II 2× Green Master Mix (NZYTech, Portugal), que contém Taq polimerase, dNTPs e
tampão de reação. O DNA foi diluído (1:10), e o mix de reação preparado com
6,25 µL de master mix, 14,75 µL de água estéril, 1 µL de primer forward (5’
TCTGTTATGTTGCTCTTGAT 3'), 1 µL de primer reverse (5’ GTTCGTATGACTTCTCCAA 3’) e
2 µL de DNA. As condições de PCR no termociclador (Thermocycler®) foram: 95 °C por 3 min (inicial), desnaturação
da actin a 95 ºC por 3 min, Anelamento a 53 °C por 30 seg, a extensão a 72 °C por 30 seg, com 35 ciclos e com extensão
final a 72 °C por 5 min. O produto foi analisado em gel de agarose.
Antes de iniciar este protocolo, você terá de ter realizado a extração de DNA.
Este protocolo foi desenvolvido e realizado no Laboratórios de Biologia Molecular e Celular/47409 da Universidade de Aveiro
Por que a PCR é importante?
A PCR (reação em cadeia da polimerase) é uma técnica de laboratório rotineiramente utilizada para produzir múltiplas cópias de uma região específica do DNA, permitindo a sua análise detalhada. Esta região pode ser escolhida conforme o interesse do investigador, como um gene para estudo funcional ou um marcador genético para identificação forense. O objetivo principal da PCR é obter DNA suficiente para análises subsequentes, como sequenciação, visualização em gel de eletroforese ou clonagem em plasmídeos para experiências futuras.
Etapas da PCR e o que acontece com o DNA
A PCR é composta por três etapas principais, que se repetem em ciclos para amplificar uma sequência específica de DNA. Estas etapas são realizadas em um termociclador, que ajusta as temperaturas necessárias para cada fase do processo.
1. Desnaturação (95°C)
Nesta etapa inicial, a amostra de DNA é aquecida a uma temperatura elevada (normalmente cerca de 95°C). Este calor rompe as ligações de hidrogénio entre as bases complementares do DNA, separando as duas cadeias e convertendo o DNA de dupla hélice em cadeias simples.
📌 O que acontece: O DNA de dupla cadeia é desnaturado, criando dois moldes de cadeias simples para a próxima etapa.
2. Anelamento (50-65°C)
Após a desnaturação, a temperatura é reduzida para permitir que os primers (oligonucleótidos curtos complementares às extremidades da sequência alvo) se liguem às cadeias simples de DNA. A temperatura específica para esta etapa varia dependendo da sequência e do comprimento dos primers.
📌 O que acontece: Os primers reconhecem e ligam-se às regiões complementares no DNA moldes, delimitando a área a ser amplificada.
3. Extensão ou Elongação (72°C)
A temperatura é ajustada para aproximadamente 72°C, que é ideal para a atividade da DNA polimerase (geralmente a Taq polimerase, termoestável). Esta enzima sintetiza novas cadeias de DNA, adicionando nucleótidos complementares (dNTPs) ao longo da cadeia moldes, começando nos primers.
📌 O que acontece: O DNA polimerase alonga a cadeia de DNA, duplicando a sequência-alvo. Este processo produz duas moléculas de DNA de cadeia dupla a partir de uma única molécula inicial.
Repetição dos Ciclos
Estas três etapas (desnaturação, anelamento e extensão) são repetidas entre 25 e 40 vezes, dependendo da aplicação e da quantidade de DNA necessária. A cada ciclo, a quantidade de DNA-alvo dobra, resultando em milhões ou bilhões de cópias após múltiplos ciclos.
E como se utiliza esse resultado?
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