Protocolos Laboratoriais para Totós

  Botrytis cinerea Botrytis cinerea , é um fungo filamentoso reconhecido como um patógeno de plantas causador da doença do mofo cinzento em diversas culturas agrícolas (Bi K et al., 2022). É um fungo que mata lentamente as células do seu hospedeiro para poder se alimentar. Em Portugal, pode causar grande impacto em vinhedos, causando a necrose de agriculturas inteiras (Figura 1). No entanto, B. cinerea pode ser aproveitado para a produção de vinhos doces de alta qualidade, como o Grandjó Late Harvest (Real Companhia Velha), assim como na medicina e biotecnologia, sendo explorado na produção de antibióticos, enzimas e outros compostos bioativos ( (Shad et al.,2009).  Figura 1 : Captura de imagens do fotógrafo Peter Lippmann retratando bagos destas uvas castigadas pelo fungo Botrytis cinérea Referências: 1.Shah, P., Gutierrez-Sanchez, G., Orlando, R., & Bergmann, C. (2009). A proteomic study of pectin-degrading enzymes secreted by Botrytis cinerea grown in liquid c...

  Imagem BioRender Team Eletroforese em Gel: Método e Princípios A eletroforese em gel é uma técnica laboratorial utilizada para separar misturas de DNA, RNA ou proteínas com base no seu tamanho molecular. Durante o processo, as moléculas são deslocadas por um campo elétrico através de um gel que possui pequenos poros. A velocidade com que as moléculas se movem no gel está inversamente relacionada ao seu comprimento, ou seja, moléculas menores migram mais rapidamente e percorrem distâncias maiores do que moléculas maiores. Como mencionado, a eletroforese em gel envolve um campo elétrico, onde uma extremidade do gel é carregada positivamente e a outra negativamente. Como as moléculas de DNA e RNA possuem carga negativa, são atraídas em direção à extremidade positiva do gel. No caso das proteínas, que não possuem uma carga fixa, é necessário tratá-las previamente com um detergente específico, o dodecil sulfato de sódio (SDS). Este detergente desnatura as proteínas, fazendo com qu...

  Created in BioRender.  Dallavecchia, D.L (2025) https://BioRender.com/z53a801   Para quantificar as proteínas, foi utilizado o método de Biureto conforme o protocolo do fabricante. Resumidamente, 7 tubos de 15 mL foram utilizados para preparar o branco, 4 amostras standards e 2 tubos com mioglobulina previamente preparados, todos os tubos tiveram os reagentes acrescentados. Após incubação a 37 °C/ 30 min, alíquotas de 1 mL foram transferidas para cuvetes e lidas no espectrofotómetro (Abs 540 nm).  Este protocolo foi desenvolvido e realizado no Laboratórios de Biologia Molecular e Celular/47409 da Universidade de Aveiro

Created in BioRender.  Dallavecchia, D.L (2025)  https://BioRender.com/z53a801   Antes de iniciar este protocolo, você terá de ter realizado a extração de DNA  ou RNA . Num microtubo contendo 5 μL da amostra desejada (DNA ou RNA) foram adicionados 995 μL de Tris 10 mM, pH 7,5. O conteúdo foi diluído (1:10) e transferido para uma cuvete de quartzo onde a absorvância a 280 e 260 foi medida. Este protocolo foi desenvolvido e realizado no Laboratórios de Biologia Molecular e Celular/47409 da Universidade de Aveiro Quantificação de DNA por espectrofotometria A medição da quantidade de DNA por espectrofotometria baseia-se na capacidade do DNA em solução de absorver luz a um comprimento de onda de 260 nm. Quanto maior for a luz absorvida nesse comprimento de onda, maior será a concentração de DNA na solução. Sabendo que uma absorbância (A) de 1,0 equivale a 50 µg de DNA de cadeia dupla por mililitro (mL), é possível determinar a concentração de DNA presente nas amostras ana...

Created in BioRender.  Dallavecchia, D.L (2025)  https://BioRender.com/z53a801    A quantificação foi realizada com NZYSupremeqPCR Green Master Mix (NZYTech, Portugal), contendo enzima hot-start e tampões otimizados. Uma amostra de DNA ambiental de planta foi fornecida, já diluída (1:10). O mix foi preparado com 10 µL de master mix, 6,4 µL de água estéril, 0,8 µL de primer forward, 0,8 µL de primer reverse e 1 µL de DNA. As condições de qPCR no termociclador foram: 95 °C por 3 min (inicial), seguido de 40 ciclos de 95 °C por 5 seg e 60 °C por 15seg. Os resultados foram analisados em tempo real no software do termociclador. Este protocolo foi desenvolvido e realizado no Laboratórios de Biologia Molecular e Celular/47409 da Universidade de Aveiro    Maiores informações PCR

                    Created in BioRender.  Dallavecchia, D.L (2025)  https://BioRender.com/z53a801     Amplificação de ácidos nucleicos por PCR e quantificação por qPCR A amplificação foi realizada com NZYTaq II 2× Green Master Mix (NZYTech, Portugal), que contém Taq polimerase, dNTPs e tampão de reação. O DNA foi diluído (1:10), e o mix de reação preparado com 6,25 µL de master mix, 14,75 µL de água estéril, 1 µL de primer forward (5’ TCTGTTATGTTGCTCTTGAT 3'), 1 µL de primer reverse (5’ GTTCGTATGACTTCTCCAA 3’) e 2 µL de DNA. As condições de PCR no termociclador ( Thermocycler ®) foram: 95 °C por 3 min (inicial), desnaturação da actin a 95 ºC por 3 min, Anelamento a 53 °C por 30 seg, a extensão a  72 °C por 30 seg, com 35 ciclos e com extensão final a 72 °C por 5 min. O produto foi analisado em gel de agarose. Antes de iniciar este protocolo, você terá de ter realizado a extração de  DNA . Este protocolo f...