Protocolo de Extração de RNA De Fungo Filamentoso

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Created in BioRender.  Dallavecchia, D.L (2025) https://BioRender.com/z53a801 

O RNA total foi extraído usando o kit NZY Total RNA Isolation (NZYTech, Portugal). Cerca de 100 mg de micélio foram triturados em nitrogénio líquido, lisados com tampão NR e β-mercaptoetanol, e clarificados numa coluna NZYSpin Homogenization. O eluído foi misturado com etanol a 70% e transferido para uma coluna NZYSpin Binding. Após lavagens com tampões NI, NWR1 e NWR2, o RNA foi eluído com água livre de RNase e armazenado a -20 °C.

Este protocolo foi desenvolvido e realizado no Laboratórios de Biologia Molecular e Celular/47409 da Universidade de Aveiro


Por que extrair RNA?

O objetivo da extração de RNA é obter RNA purificado de alta qualidade de amostras biológicas para análise transcriptómica para aplicações como sequenciamento, análise de transcriptoma e testes de patógenos infeciosos.
O RNA é uma molécula instável, principalmente porque ele pode ser degradado por RNAses, as quais estão presentes em vários materiais biológicos, como por exemplo a nossa pele, no perdigoto (gotículas) da nossa saliva, gordura, etc.

Quantificação da concentração e pureza

1) Como é calculada a concentração de ácidos nucleicos?

  • As concentrações de ácidos nucleicos podem ser calculadas diretamente a partir de seus valores de absorbância medidos a 260 nm, usando a equação de Beer-Lambert:
    onde:
    onde:
C= concentração de ácido nucleico em molar (M)
  • A=Absorbância UV em unidades de absorbância (UA)
  • ε=coeficiente de absortividade molar dependente do comprimento de onda (ou coeficiente de extinção) em M -1 cm -1
  • L= caminho da luz em cm (cm)

      • Este cálculo de concentração é automatizado em muitos instrumentos, podendo fornecer medidas diretas de medição de pureza
    2) A pureza pode ser calcula da seguinte forma: 

    • Fórmula Maniatis: [leitura X fator de diluição X OD260 RNA] = ng/uL
    • Fórmula Alternativa: [leitura X fator de diluição]/25 = ug/uL

    👉A razão 260/280 deve dar entre 1.8 e 2.0 para a extração ser livre de contaminação. 

    OD260 para DNA dupla fita: 50 ug/mL
    OD260 para DNA simples fita e RNA: 40 ug/mL
    OD260 para oligos simples fita: 20 ug/mL


    Veja mais aqui e  aqui








     

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